一、流式細胞術簡介

流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是利用流式細胞儀對單個細胞或微粒的理化、生物學特征進行分析以及根據這些特征精確分選細胞的技術。流式細胞術應用廣泛，不僅在免疫學、細胞生物學和分子生物學等基礎研究方面必不可少，而且在臨床對多種疾病的輔助診斷以及治療方面也發揮出極大作用。

流式細胞儀通常由液流系統、光學系統和電子系統三部分組成（圖1）。其工作原理是熒光標記的單細胞液流被激光照射后，發出一定波長的熒光并通過不同濾光片，電子檢測設備收集并分析熒光信號，并將各通道的數字轉換為圖形顯示。

二、北京市肝病研究所流式平臺構成

北京市肝病研究所的流式平臺由四臺流式細胞儀組成，分別是BD FACSCalibur流式細胞儀、BD FACSJazz流式細胞分選儀、ImageStreamX MarkII量化成像分析流式細胞儀、和CyTOF2質譜流式細胞儀。四臺流式細胞儀囊括了細胞分析、細胞分選、流式細胞成像、和高通量無補償流式細胞術，對肝病研究具有極其重要的作用。

（一）BD FACSCalibur流式細胞儀

BD FACSCalibur流式細胞儀（圖2）可提供兩激光四色的樣本檢測，儀器的參數設置如表1所示。該儀器操作簡單，能滿足細胞凋亡與周期檢測、DNA倍體分析、熒光報告基因表達和轉染效率判定等基本的科研實驗需求。

（二）BD FACSJazz流式細胞分選儀

BD FACSJazz流式細胞分選儀（圖3）配置了兩激光六色的熒光檢測，具體參數見表2。該儀器機身小巧，光學平臺緊湊，具有新型的液流控制臺和分選軟件，能夠實現常規的細胞分選應用。BD FACSJazz提供兩路分選，能夠直接看到分選倉內情況，并有多路視頻信號對分選情況進行實時監控，增加了細胞分選的可控可測性能。

（三）ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細胞儀

ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細胞儀（圖4）具有三激光十二通道的檢測性能，能夠檢測的熒光素見表3。該儀器將流式細胞儀的速度、敏感性和表型分析能力與熒光顯微鏡的細節成像能力相結合，所獲得的廣泛應用是無論單獨流式細胞儀或熒光顯微鏡都根本無法做到的。儀器具有十二個檢測通道，能夠對通過流動室的細胞逐個采集圖像，并利用圖像分析軟件對每個細胞圖像的形態學參數進行量化分析，可廣泛應用于免疫學、腫瘤學、生物化學、干細胞、病原微生物、海洋學等多種學科的研究。

ImageStreamRX MarkII量化成像分析流式細胞儀應用舉例：

（四）CyTOF2質譜流式細胞儀

CyTOF2流式細胞儀通過對傳統流式技術和質譜技術的整合，徹底解決了熒光串色的問題，并實現了幾十個參數的同時測量。其強大的數據獲取能力與現代信息生物學的分析手段緊密結合，對生物學多個領域的研究具有重大的推動作用。在血液學領域，它可以對復雜的樣品進行精細的免疫分型和信號通路分析；在免疫學的研究中，可以對免疫細胞進行自動分群，并對免疫細胞的功能多態性進行細致分析；在癌癥研究領域，它可以對癌癥組織進行精細的亞群分析，幫助研究者找到與臨床預后密切相關的細胞亞群；在干細胞研究領域，可以深入探討當前技術下所區分出的干細胞群體的異質性，對于以后干細胞治療等領域具有重要的指導意義。

與傳統流式細胞技術相比，CyTOF流式細胞技術具有以下優勢：1）檢測通道數量多CyTOF流式細胞儀中配備的ICP-TOF質譜裝置具有非常寬的原子量檢測范圍（88～210Da），因此可以同時檢測上百個不同的參數。2）通道間無干擾，無需計算補償ICP質譜裝置具有超高的分辨能力，可以完全區分開用來標記的各種元素（如右圖所示）。所以解決了困擾傳統流式的“串色”問題，使實驗流程得到簡化，也節約了樣品和試劑。3）金屬標簽數量多，并具有極低的背景金屬標簽是通過多聚螯合物實現與抗體的共價偶聯，這種金屬螯合物與細胞組分的非特異性結合極低，同時選擇作為標記的鑭系金屬，在細胞中的含量基本為零，因此其信號背景極低。

三、流式技術平臺的作用和意義

北京市肝病研究所研究人員長期從事肝病相關的研究，對自噬、信號通路和免疫學方面的研究也處于領先水平。肝病研究所擁有上述四臺流式細胞儀，十分必要對大型儀器進行合理地規劃和使用維護。建立流式技術平臺，目的為研究所和佑安醫院的科研工作服務。四臺流式細胞儀能夠滿足眾多科研工作需求，包括細胞周期檢測、自噬與凋亡水平檢測、各種細胞表面標志測定、細胞分選等。

新型的ImageStreamX MarkII量化成像分析流式細胞儀由于結合了傳統流式細胞術與熒光顯微成像技術，將傳統流式的應用范圍拓展到了基于圖像分析結果的領域，如共定位、細胞間相互作用、內吞等，因此更是實現高水平科研的利器。無論是免疫學、生物化學等基礎生命科學研究，或者是腫瘤學、病理學等醫學相關研究，量化成像分析流式細胞儀都有十分廣泛的應用。目前利用量化成像分析流式細胞檢測技術已經發表了超過300篇的同行評議文章，其中已有多篇文章發表在Science、Nature、Immunity等頂尖雜志上。

將研究所的研究方向和CyTOF流式細胞儀的優勢結合起來，該平臺對研究所的發展具有重大的作用和意義：在肝癌方面，可以同時檢測多個肝癌早期診斷分子，并且CyTOF流式細胞儀不僅可以細致觀察出各個病人組織細微的差異，也可以從多態性的群體中總結出規律性的結論，對癌癥的研究和治療具有重要的指導意義；在肝再生方面，CyTOF流式細胞儀具有通道多、無串色的優勢，將極大促進干細胞的研究，并且可以深入細胞內部對信號通路、細胞增殖、細胞周期等進行精細分析；在肝病免疫學研究方面，CyTOF流式細胞儀可以進行免疫細胞的自動分群，展現細胞亞群內部的多態性，從而更加深入研究免疫反應機制。

四．流式技術平臺的診斷和科研用途

肝臟是人體重要的免疫器官。來自全身和腸道的血液流經肝臟，攜帶了各種營養物質，也包含了許多抗原物質，它們與眾多免疫細胞在肝臟內相互作用，挑戰著肝臟內部的免疫穩態。因此，肝臟疾病大多都是免疫穩態被打破的結果。利用流式細胞儀可對HBV感染過程中各種細胞的功能狀態進行分析，結合HBV DNA定量檢測、肝臟轉氨酶水平、凝血酶原水平、血常規等檢測，對肝炎和肝癌發生發展和治療起到重要作用。

目前肝病研究中流式細胞儀的主要應用有：

1）常規檢測HBV感染患者外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中各種免疫細胞的數量和比例，如T/B/NK細胞檢測、CD4/CD3/CD8/CD45檢測、Th1/Th2/Th17/Treg檢測等；

2）檢測HBV感染患者PBMCs表面的各種免疫分子，如HLA-DR、CD80、CD86、PD-1、CTLA-4、TLRs等；

3）檢測HBV感染患者血清中的各種細胞因子水平；

4）檢測切除肝癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor infiltrated lymphocytes, Tils）組成；

5）細胞治療：從患者PBMCs中分選感興趣的目的細胞，在體外進行誘導擴增培養，再回輸至患者體內，達到免疫治療肝病的目的。常用的免疫回輸細胞有：細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine induced killer, CIK）；DC-CTL；iAPA（inhibition of antigen presentation attenuators）-DC-CTL；DC-CIK等。

五．北京市肝病研究所流式技術平臺可提供的服務項目

1. 細胞表面標記檢測和胞內細胞因子檢測

2. 細胞凋亡檢測

3. 細胞周期檢測

4. 細胞增殖檢測

5. 細胞分選

6. 成像流式檢測，包括熒光信號共定位、內化、蛋白質核轉位、細胞形變等

7. 質譜流式檢測

以上服務均為收費項目，如有使用需求，請與平臺負責人聯系。聯系電話：83997425。

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